qPCR的数据分析根据应用的不同可以分成相对定量和绝对定量两种。例如，处理组细胞与对照组细胞相比，A基因的mRNA改变了多少倍，这就是相对定量；那如果说在一定数目的细胞中，A基因的mRNA有多少个拷贝，这就是我们说的绝对定量。通常在实验室中用的最多的就是相对定量的方法了。
首先我们先了解一下绝对定量的原理及数据分析流程。
绝对定量的原理和方法
Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，即得到该扩增反应存在的线性关系，即
Log2X0 = Log 2M - Ct Log2（1＋En）
根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量。
对于绝对定量我们需要确定几个要素：
• 一个目的基因 ——即需要确定其量值的核酸序列。
• 一组标准样本 ——用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、PCR产物、基因组DNA等。
• 重复反应孔 –——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保区分并去除因加样失误导致的误差孔。
• 标记方法的选择 ——SYBR Green I 法或Taqman 探针法均可。
• 实验结果显示 ——扩增曲线；标准曲线；融解曲线(探针法不需要)。
我们以染料法为例，给大家展示在绝对定量中的分析流程：
质粒标准品的制备：
首先设计一对引物从基因组DNA上扩增一段含有目的基因的片段，一般来说这个片段最好是比qPCR扩增的目的片段长100bp左右，然后将扩增的片段连接到载体上构建质粒载体，再转到大肠中进行克隆复制，经过质粒的提取及OD值定量或qubit定量（qubit定量从原理上来说要比OD值测定更准确，因此推荐qubit进行质粒浓度测定，推荐使用启衡星qubit试剂盒，性能优越，稳定），我们就可以将质粒梯度稀释得到一组标准品。
质粒标准品拷贝数的计算及稀释方法
拷贝数的计算
1OD260=50ng/μL双链DNA，待测样本浓度（ng/μL）= OD260×50（×稀释倍数）
1μL双链DNA标准品物质的量（mol）=(稀释倍数×OD数×50×10-9)/（序列长度×649）
1μL双链DNA标准品的数量（copies）=(稀释倍数×OD数×3×1016)/（序列长度×649）
质粒标准品倍比梯度稀释方法：
1V原液（标准品Ⅰ）+ 9V稀释缓冲液，得标准品Ⅱ
1V标准品Ⅱ+ 9V稀释缓冲液，得标准品Ⅲ
1V标准品Ⅲ+ 9V稀释缓冲液，得标准品Ⅳ
1V标准品Ⅳ+ 9V稀释缓冲液，得标准品Ⅴ
绝对定量实验例-拟南芥中A基因的绝对定量
试剂：启衡星SYBR Green qPCR Mix
标准品：质粒标准品设置5个浓度梯度，分别3个重复；并设置阴性对照；
实验步骤：设计A基因qPCR特异性引物
提取拟南芥基因组DNA
荧光定量PCR 扩增实验
结果分析，计算得出拟南芥样品中A基因的copy数。
标准曲线制作：利用Mean Ct 作图可得到标准曲线
y = -3.481x + 40.123 R2 = 0.9996
扩增效率（E）计算
E =10-1/斜率-1
=10-1/-3.481 -1
=1.983-1
=0.938
相关系数（R2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。
扩增效率（E）：0.8-1.2, 越接近1，越理想。
标准差STD一般要求小于0.5，在比较严格的实验中，要求小于0.2。
样品中A基因的拷贝数计算：
将Ct值带入线性方程：
18.45= -3.481 X +40.123中，即可计算出未知样品的拷贝数；
将Ct值带入线性方程：
18.45= -3.481 X +40.123
相对定量
比较两个或两个以上样本中、或处理组与对照组某个基因表达量的变化
适用于您只关注样本间基因表达量的差异，不关心某基因的绝对表达量；
同样，对于相对定量，我们也需要关注几个因素：
• 一个参照样本
• 一个或一个以上的未知样本
• 目的基因
• 一到两个管家基因——用来校对不同样本之间目的基因的实际表达量（对于管家基因的选择我们上上期的内容-实验室设计中已经给大家分享，大家可以翻阅我们前期的内容进行查阅）
• 重复反应孔——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保区分并去除因加样失误导致的误差孔。
• 标记方法的选择——SYBR Green法或探针法均可
• 实验结果显示——扩增曲线；标准曲线（有些分析方法不需要）；融解曲线（探针法不需要）
• 标准样本（有些分析方法不需要）
对于相对定量，最常用的有两种方法：
（1）双标准曲线法
通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行绝对定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。
双标准曲线法实验例-盐处理油菜中A基因的相对定量
试剂：启衡星SYBR Green qPCR Mix
标准品：质粒标准品设置5个浓度梯度，分别3个生物学重复；每个样品同样设置3个生物学重复，并设置阴性对照；
实验步骤：设计A基因qPCR特异性引物
提取处理组、对照组的RNA，并反转录为cDNA
荧光定量PCR 扩增实验
结果分析，计算出待测样品1和2与对照组相比目的基因A的表达量是上升了，还是下降了？
实验数据
检测样品 目的基因A 管家基因H 定量结果 定量结果 校正值 相对量 对照样品 1234 5678 0.217 1.000 待测样品1 1124 5578 0.201 0.926 待测样品2 1089 5789 0.188 0.866
从定量结果可以看出，待测样品1和2相对于对照样品在目的基因A的表达量上有所下降。
总结：
双标准曲线法优点：数据最准确，不用考虑扩增效率不好的影响；分析简单，实验优化相对简单
双标准曲线法缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线
应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一
（二）相对定量分析－－2－△△Ct法
公式
2－△△Ct法实验例--胁迫处理后，油菜中A基因的相对定量
Sample 目的基因 (Mean Ct) GAPDH (Mean Ct) E 处理前 15 13 1.95 处理后 18 20 1.95
2 - △△Ct法：假设目的基因和参照基因扩增效率都接近100%
△Ct（处理前）＝15－13＝2 △Ct（处理后）＝18－20=－2
△△Ct=△Ct（处理后）－△Ct（处理前）＝－2－2＝－4
比率（处理后/处理前）＝2－△△Ct＝2－（－4） ＝16
所以目的基因在处理后表达水平是处理前的16倍
小结
• 优点：无需作标准曲线，实验流程相对简单；
• 缺点：
假定扩增效率为 100 %；
假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致；
实验条件优化较为复杂。
因此采用此方法进行计算分析，再我们不知道扩增效率的时候，我们得到的结果可能会与实际结果有很大偏差。但是它也可以通过做标准曲线，看扩增效率进行校正，因此在实际操作的时候，推荐大家做一下标准曲线，看实际的扩增效率然后进行结果的校正，确保更准确的结果。
修正方法：如果我们知道目的基因和参照基因有相同的扩增效率，但扩增效率不等于2，那么2－△△Ct可以修正为：E－△△Ct，例如扩增效率为1.95，那么计算公式可修正为 1.95－△△Ct
2－△△Ct法是基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一
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